基迪奥合作客户文章小RNA揭示血管平滑

发表期刊：JournalofClinicalInvestigation

影响因子：13.

合作单位：广州市妇女儿童医疗中心

我们在做研究的时候，有时候会发现自己做的实验结果和广为人知的结论不太一样，这个时候就会产生自我怀疑，是不是哪里实验出问题了，是不是处理和对照做反了，等等一系列的灵魂拷问。

但有时候我们可以换种思路，是不是在实验的过程中存在某些未知的调控机制，但这些机制我们还没有发现，因此得出了与预期不符合的结果呢。那么这个未知的调控机制该如果研究呢，我们将用一篇基迪奥客户的文章来进行解答。

文章概要

当我们的血管受到损伤时，最初的反应是维持凝块形成、血管收缩和细胞增殖从而止血，这种即时反应主要由血栓素和PDGF等物质介导，这些物质是从活化的血小板中释放，并促进VSMC（血管平滑肌细胞）去分化。

但当损伤修复后，VSMC的去分化不减弱就会发生大量的内膜增生，因此又需要预防过渡修复（即将VSMC切换回分化的静止状态）。血管损伤的修复和预防过度修复的过程涉及VSMC去分化和分化。

作者从免疫荧光技术、荧光素酶报告实验、Westernblot实验、miRNA测序等多种方法全面的进行了研究，发现miR-通过下调PDGFRβ基因从而抑制VSMC的脱分化，将脱分化的状态转为分化，解释了VSMC的损伤修复机制。

实验方法

血管平滑肌细胞（VSMC）空白组，与血小板共培养的处理组，每组三个重复进行miRNA测序。

研究思路

作者通过发现与预期不符的结果，提出miRNA可能在其中起的作用，对miRNA及其靶基因进行验证，最终发现了VSMC损伤修复的模型。

研究思路

研究结果

1.发现问题——血小板诱导VSMC分化

在最开始的实验中，作者将活化血小板（APs）和人主动脉血管平滑肌细胞VSMC共培养，预期的结果是血小板会诱导VSMC去分化。但是结果却出乎意料，经APs共培养的VSMC的分化标志物的蛋白表达明显高于静止血小板共培养(RPs)和无血小板共培养(Ctrl)，同时VSMC去分化标志物同时显著降低（图1），表明活化的血小板反而诱导了VSMC的分化。

这个结果与众所周知的血小板活化会促进VSMC去分化这一观念相反。那么在这个结果背后应该有其他的分子参与进来，作者首先想到了miRNA，血小板中的miRNA是比较理想的分子，因为它们可以催化调节许多蛋白质，确保VSMC回到分化的静止状态。因此开展了后续的研究。PS：miRNA还会调控靶基因导致抑制蛋白翻译，如果我们做实验发现mRNA和蛋白的结果相反时，也可以考虑下是否有miRNA在其中起作用哦~

图1.VSMC的分化和去分化标志物的表达情况

2.找到原因——活化的血小板将mirna转移到VSMC中以抑制VSMC的去分化

作者通过体内和体外实验，发现在动脉损伤时活化的血小板被转移到VSMC的内部。内化的血小板必须包含有效的药物来启动从VSMC去分化到分化的转换，而血小板中有大量的miRNA。作者通过与活化血小板共培养的VSMCs的透射电镜成像，证明了miRNA从内化的活化血小板转移到VSMCs中。

为了寻找参与VSMC去分化过程中起作用的血小板miRNA，作者对与血小板共培养（APs）或空白组(control)的VSMC进行miRNA测序。通过miRNA测序找到许多差异表达的miRNA，在其中找到关键miRNA：miR-，miR-/。

为了进一步验证miRNA在其中的作用，作者使用前列环素(防止血小板活化)或RNaseA(降解RNA)预处理血小板，结果发现会显著降低VSMCs中miR-和miR-/的表达（图2C），而前列环素和RNaseA的预处理会显著降低APs对VSMCs的促分化作用(图2D)。

这些结果显示VSMCs通过吸收活化血小板，使血小板miRNA水平转移到VSMCs，从而使VSMC去分化的状态转化为VSMC分化。

3.寻找miRNA的靶基因

由于miRNA通过靶向mRNA起作用，因此作者通过生信分析和荧光素酶报告基因检测，发现了miR-、miR-和miR-的靶基因KLF4、KLF5和PDGFRβ。

为了进一步证明血小板miR-、miR-和miR-确实对VSMC表型转换至关重要，作者进行了挽救实验。

在正常葡萄糖水平和高糖条件下研究miR-、miR-和miR-和其靶基因KLF4、KLF5和PDGFRβ的表达量变化情况。作者发现在共培养早期(6-12小时)，血小板释放的PDGF促进VSMC增殖，miR-在VSMCs中积累。随后(24-48小时)，VSMCs利用miR-抑制细胞增殖及靶基因PDGFRβ的表达(图3)。

综上所述，这些数据表明血小板释放的miRNA是VSMC转化的主要调控因子。

图3.细胞增殖率、miR-和PDGFRβ的表达情况

4.验证靶向关系

虽然上一步通过表达量的关系，作者推测出了miR-和PDGFRβ的关系，但是还需要进一步进行验证。因此作者在受伤和未受伤的股动脉中进行了miR-抑制试验。在未受伤的血管中，PDGFRβ的表达很低。在损伤后4周，相比于对照组，miR-被抑制的实验组中PDGFRβ的表达上调（图4）。这些结果表明,PDGFRβ的确是miR-的靶基因。

miR-、miR-同时存在于血小板和VSMC中，而miR-特异性表达于造血系统（包括血小板）中，在VSMC没有显著表达。因此作者还进行了一项实验，证明在VSMCs共培养中内化的活化血小板的miR-水平明显高于活化血小板衍生微粒。结合之前发现的内化血小板的大小和形态，这些研究表明了miR-是从激活的全血小板转移到VSMC中，并促使了VSMC的表型转换。

图4.受伤股动脉的VSMCs中PDGFRβ的表达情况

5.在糖尿病患者中推测理论

在糖尿病等病理条件下，血小板中的miRNA水平会发生改变，而作者研究观察到患糖尿病（DM）的人和小鼠的血小板中miR-的表达降低（图5），因此作者对DM和WT小鼠进行研究，通过荧光原位杂交发现，在DM条件下，尽管血小板被内化到VSMCs中，但血小板中的mirna水平转移明显减少，并且导致它们的靶基因在体内的表达增加。

这些结果与之前的体外研究结果一致，即血小板来源的miR-水平转移到VSMC，通过下调PDGFRβ从而抑制VSMC的去分化。但DM的条件下，miR-的表达降低，PDGFRβ的表达增加，导致血管平滑肌细胞增殖和内膜的增生。

图5.miR-在健康受试者和DM患者、非DM小鼠和DM小鼠血小板中的表达

6.模型——提出了正常和DM血小板中mirna转移到受损血管VSMCs的模型

通过上述一系列的研究，作者提出了VSMC损伤修复机制的模型：在正常生理过程中，内皮屏障是完整的，血小板是静止的，与VSMC没有相互作用。当受到损伤时，内皮屏障受损，暴露内皮下层，导致血小板活化。

除了血栓形成外，还释放出可启动伤口修复的药物，包括诱导VSMC脱分化和细胞增殖。激活的血小板随后被VSMC吸收，并释放miR-以及其他如miR/，这些miRNA对VSMC脱分化起抑制作用，转而向VSMC分化。后续延迟反应会阻止VSMC的过度修复，从而减少内膜增生。但在miR-减少的DM血小板中，VSMC会发生过度增殖导致内膜的过度增生。

图.VSMC损伤修复模型

小结

作者首先从前期实验发现了与预期相反的结果中提出了假设：可能存在miRNA在其中起作用，随后找出可能起作用的miR-，并对其验证；接着寻找miR-的靶基因PDGFRβ，并验证了靶向关系，从而推测出VSMC损伤修复的模型。

除了在正常水平下，作者还想到了糖尿病的情况下miRNA的表达会降低，从而推测出糖尿病情况下VSMC的损伤修复模型。在一步步的抽丝剥茧中将VSMC损伤修复的机制完整的展现出来，是一个非常值得借鉴的文章思路哦。

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